標(biāo)簽： 限制性內(nèi)切酶 消化 DNA
影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應(yīng)體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應(yīng)時(shí)間來加以克服。
實(shí)驗(yàn)方法
進(jìn)行限制酶切割反應(yīng)只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強(qiáng)度、溫育溫度和時(shí)間都依具體的反應(yīng)而改變。
DNA
TE 酶切緩沖液 EDTA
電泳儀
1. 混合下列溶液于一個(gè)無菌的微量離心管中
（1）x μl DNA （2）2 μl 10×酶切緩沖液 （3）18-x μl H2O
（4）20 μl 的反應(yīng)體積可以方便地用于聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析。 （5）只要反應(yīng)混合物中其他成分的比例保持一定，可增減待切割DNA的量和反應(yīng)條件。
2. 加入限制性內(nèi)切酶（1~5 U/μg DNA）在推薦的溫度溫育1 h （—般是37℃）。 3. 理論上，1 U 限制性內(nèi)切酶在推薦的反應(yīng)條件下，60 min 內(nèi)可完全消化1 μg 純化的樣品。 4. 酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的1/10，因?yàn)槊敢褐械目梢愿蓴_反應(yīng)。
5. 加入5 μl 電泳加樣緩沖液終止反應(yīng)，進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳。
6. 反應(yīng)也可通過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（終濃度為12. 5 mol/l） 以螯合鎂離于而終止。 7. 很多酶再65℃溫育10 min 可被不可逆滅活，有些不能在65℃熱失活的酶在75℃溫育15 min 也能失活。 8. 如果酶對(duì)熱具完全抗性，可遍過酚抽提和乙醇沉淀或通過硅基質(zhì)懸浮法來純化DNA。
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